Det er unntatt offentligheten hvordan dagens moderne sannhetsserumer fungerer, men det finnes litt info om hvordan de tidligste sannhetsserumene antas å fungere.

Noen av de tidligste sannhetsserumene er blandinger av preparater som virker avslappende og fordummende slik at motakeren blir mer bekymringsløs og korttenkt som på den måten gjør dem lettere å avhøre. Slike serum består ofte av gabaergiske og antikolinerge stoffer i presise forhold. Dette medfører at serumet midlertidig reduserer hemninger og IQ hos den som får det slik at det øker sjangsen for at personen skryter eller forsnakker seg om hemmelighetene sine, men det er ikke med det garrantert at personen vil røpe noen ting.